W XVI-XVII w. pierwsze miejsce w Wilnie zajmowała religia rzymsko-katolicka. Podczas gdy katolicyzm w Wilnie wzrastał, inne religie topniały. Los prawosławia przesądziły uchwały soboru brzeskiego 1596 r.
O losie unii zdecydowało samo życie: od początku XVII w. wbrew intencjom Rzymu, szybko słabnie, tracąc wyznawców na rzecz obrządku zachodniego. Jednak w magistracie wileńskim prawne stanowisko Rusinów (Białorusinów), mimo zmniejszenia się ich odsetka na terenie miasta, nie uległo żadnym zmianom — w dalszym ciągu występują oni równorzędnie z katolikami, zajmując połowę miejsc we wszystkich urzędach municypalnych. Tak samo w cechach, które naczelne stanowisko przyznawały religii rzymsko-katolickiej, przestrzegano jednakową ilość starszych katolików i unitów lub prawosławnych.
Magistrat przyczyniał się do uświetniania procesji na Boże Ciało „rzymskie” i Zesłanie Ducha Świętego „ruskie”, kazał przygrywać na ratuszu orkiestrze zarówno w katolickie, jak i „ruskie” święta. Obok biskupa katolickiego otrzymywał od ratusza coroczne podarki metropolita unicki, obok ojców bernardynów — archimandryta bazylianów i bractwo Panny Maryi przy cerkwi św. Trójcy.
Władza duchowna katolicka, jako właściwa organizatorka unii, nie przeciwdziałała na gruncie prawa miejskiego równości wyznawców dwóch obrzędów. Mimo wszystko szeregi Rusinów (Białorusinów) topniały w Wilnie z dnia na dzień; padały w ruinę ich cerkiewki, dawniej prawosławne, a następnie unickie. Z czternastu cerkiewek początku XVI w. przetrwało do połowy XVIII w. tylko dziewięć; mnożyły się natomiast kościoły i klasztory katolickie — do trzynastu końca w. XVI przybyło w pierwszej połowie XVII w. dziesięć: sześć w mieście — św. Kazimierza, św. Ignacego. Wszystkich Świętych, św. Teresy, św. Józefa Oblubieńca, św. Katarzyny — i cztery na przedmieściach — św. Stefana, św. Józefa i Nikodema, św. Filipa i Jakuba, św. Bartłomieja.
Obok 23 świątyń katolickich i 9 unickich była jedna cerkiew prawosławna św. Ducha z bractwem przy niej, oraz dwa zbory ewangelickie — luterański i kalwiński. W XVII w. pojawiła się w Wilnie Synagoga Wielka, na Łukiszkach wzniesiono meczet muzułmański. Zgromadzenie kupieckie obejmowało wszystkich kupców bez różnicy wyznania. Cechy na ogół również tolerowały członków innych wyznań, dopuszczając zwłaszcza protestantów, do urzędów „starszych”, choć nie było ustalonego zwyczaju w tym względzie, jednak na tle różnic religijnych wynikały ostre nieporozumienia. Ogólnie jednak w wiekach XVI-XVII istniała w Wilnie tolerancja religijna.
„W 1536 roku — pisze David Frick — po tym, jak nowo wybrany magistrat okazał się w stu procentach ruski lub inaczej „grecki” (tzn. prawosławny), „Lachy” — termin zazwyczaj oznaczający Polaków — uzyskali od króla Zygmunta I specjalny przywilej. Ustanawiał on równy podział między „Grekami” i „Rzymianami” we wszystkich przyszłych wyborach do urzędów magistratu miejskiego, poczynając od ławników i rajców, a kończąc na burmistrzach. W tym czasie (tj. przed reformacją oraz przed unią brzeską), terminy „Rzymianin” i „Grek” odzwierciadlały w sposób jednoznaczny oba wyznania chrześcijańskie reprezentowane w zarządzie miasta, choć każde z tych pojęć mogło obejmować więcej niż jedną grupę etniczną. Wraz z rosnącym rozszczepieniem rzymskiego i greckiego chrześcijaństwa w ciągu XVI wieku, coraz więcej grup wyznaniowych konkurowało o miejsca przeznaczone „Rzymianom” i „Grekom” („Rzymianinem” mógł być teraz katolik, luteranin lub kalwinista. A „Grekiem” unita lub prawosławny).
D. Frick potwierdza, że wraz z wzrastającą dominacją katolicyzmu, niektórym grupom było coraz trudniej osiągnąć wyższe urzędy. „Niemniej jednak — pisze Frick — zasada rzymsko-greckiego parytetu nigdy nie została naruszona i osoby z „marginesowych” ugrupowań będą wybierane i zaprzysięgane na urzędy w Wilnie jeszcze po „zwycięstwie” kontrreformacji.
System parytetu stworzony na potrzeby magistratu miał swoje odpowiedniki wewnątrz innych świeckich korporacji wileńskich. Wiele cechów dzieliło władzę między wyznaniami i „narodami” w sposób precyzyjnie regulowany.
Stosunki narodowościowe rozwijały się mniej więcej po tej samej linii, co i religijne. Od końca XIV w. zaczynają napływać do Wilna mieszczanie Polacy: kupcy w interesach handlowych, rzemieślnicy nie tylko z własnej inicjatywy, lecz sprowadzani także przez dwór wielkoksiążęcy, możnowładców i klasztory, zwłaszcza do murowania kościołów i innych gmachów.
Słabi liczebnie przybysze z Polski górowali nad miejscowym elementem wyższą kulturą, która w szybkim tempie zaczynała podbijać Wilno. Siła atrakcyjna tej kultury zostaje jeszcze wzmocniona przez działanie na jej korzyść czynników wewnętrznych, zaznaczających się na wszystkich polach życia państwowo-społecznego. Mieszczanie, urządzający na wzór zachodni swój samorząd; duchowieństwo katolickie, początkowo wyłącznie polskie i długo jeszcze wzmacniane rezerwami z Polski; możnowładcy i szlachta, zdobywająca dla siebie coraz lepsze pozycje w Wielkim Księstwie, podobne do takich warstw w Koronie, wreszcie dwór, organizowany na modłę krakowskiego — wszystkie te czynniki bezwiednie, drogą naturalnej percepcji dokonywały polszczenia kraju w ogólności, a w szczególności stolicy, Wilna.
Charakterystycznych wskazówek pośrednich dostarczają w tej kwestii przywileje miejskie; język tych dokumentów — dekretów, ordynacji, listów królewskich — jest w wiekach XVI-XVII w 50 proc. łaciński, w 45 proc. ruski (starobiałoruski), a tylko w 5 proc. polsk i. Polskie akta zaczęły się pojawiać dopiero za króla Stefana Batorego, w 1576, przy tym pierwszą swą ustawę — wilkierz, czyli uchwałę rady miejskiej, z roku 1551 zredagował magistrat wileński w języku polskim.
Dość szybko upowszechniał się język polski w Wilnie, gdyż — jak zbadała M. Łowmiańska — w XVII w. — do 1655 r. było już 53 proc. przywilejów w języku polskim, 37 proc. — w łacińskim i tylko 10 proc. w języku starobiałoruskim. Języka litewskiego w dokumentach nie było. A ostatni ruski (starobiałoruski) akt ukazał się w 1605 roku. Jednakże język białoruski obok łaciny w dalszym ciągu był językiem urzędowym, jak obecnie podają litewscy historycy — kancelaryjnym; użycie języka starobiałoruskiego ograniczało się jednak do akt grodzkich i trybunalskich oraz do stosunków władzy monarszej z cerkwią unicką bądź prawosławną.
W języku polskim zredagowana była uchwała z 1643 r., organizująca ludność przedmieść wileńskich dla ochrony jej interesów.
Podczas okupacji moskiewskiej w latach 1665-1661 księgi magistrackie prowadzone były już w języku polskim, także księgi rachunkowe, a także w języku polskim zredagowane instrukcje posłom miejskim wysyłanym do cara Aleksego Michajłowicza w 1658 roku, a umieszczone pod tą instrukcją 44 podpisy były polskie i tylko 9 ruskich (białoruskich) i 1 niemiecki.
Poczynając od połowy XVII wieku zaczyna się polonizacja mieszkańców Wilna. Wszyscy tzw. „rzymianie”, tj. katolicy byli już, jak sądzi badaczka M. Łowmiańska, spolonizowani, „prócz garści Niemców”. M. Łowmiańska podaje, ze w królewieckim rejestrze Niemców wileńskich, którzy schronili się w Królewcu w 1655 r. przed najazdem Moskwy, składających na piśmie w imieniu swoim, rodzin swych, czeladzi i sług zobowiązanie lojalności wobec kurfirsta, było „119 nazwisk przedstawicieli rodzin, w tym sześć kobiet: pięć wdów i jedna, której mąż powrócił do Wilna; 17 nazwisk osób, do tych rodzin należących, 16 nazwisk czeladzi, uczniów, sług, wreszcie 14 osób, częściowo tylko z nazwiska i zawodu wymienionych. Razem 166 osób, z których 50 proc. stanowili rzemieślnicy, 37 proc. kupcy i złotnicy; był jeden doktor medycyny i jeden adwokat z rodzinami, oraz trzech kaznodziejów: dwóch kalwińskich i jeden luterański. Nie jest to zbyt wielka ilość na 14 000 mieszkańców. Zapewne nie wszyscy Niemcy schronili się do Królewca, lecz i między tymi widzimy kilku o nazwiskach słowiańskich: Palczewski, Zaleski, Malina, Jerkiewicz, Dilo; podejrzanie brzmi Mattesius i Chelchowius, spolszczona była rodzina Giblów.”
Badaczka Wilna do 1655 roku, M. Łowmiańska, pisze, że „trudno powiedzieć coś bardziej zdecydowanego o Litwinach w ówczesnym Wilnie. Kazania litewskie u św. Jana mogły być przeznaczone przede wszystkim dla ludzi z pobliskich wsi, należących do parafii świętojańskiej”. Prof. Jan Nepomucen Fijałek, badacz uchrześcijanienia Litwy przez Polskę, przypuszcza, że w 1527 r. trafiali się w Wilnie Litwini wśród służby domowej w mieście , jak również wśród ludności przedmieść. Pisze też, że wśród mieszczan wileńskich, zamieszkałych czy to w murach, czy poza ich obrębem, byli na pewno w XVI w. Litwini. Maria Łowmiańska na dowód tego przytacza: „1. Wilkierz 1551 r. nakazuje ławnikom ogłaszać wyroki sądowe „po polsku i po litewsku”, i po rusku, aby wszyscy, którzy by słuchali, rozumieli; w „objaśnieniu” tego wilkierza z r. 1620 klauzuli powyższej nie znajdujemy — widocznie nie ma już wtedy obawy, by mieszczanin wileński mógł nie rozumieć po polsku; 2. Do zarządu cechu tkackiego płócienników, założonego w 1579 roku, należą po jednym członkowie czterech narodów — polskiego, litewskiego, ruskiego i niemieckiego; również starszym zostaje kolejno po roku Polak, Litwin, Rusin i Niemiec; według zreformowanej ustawy tegoż cechu z r. 1639 r. ukonstytuował się zarząd z przedstawicieli wyznań katolickiego i protestanckiego – o narodach, a więc i litewskim, nie ma już mowy”.
Jednakże ukazywały się w XVII wieku książki litewskie, przeznaczone dla Litwinów, ale — jak zaznacza Łowmiańska — „niekoniecznie dla wilnian. Jedynym faktem, stwierdzającym istnienie wtedy Litwinów w Wilnie, są owe kazania litewskie, wygłaszane w dalszym ciągu aż do 1737 r. Musiał jednak ten litewski element być bardzo słaby, skoro nie pozostawił po sobie żadnych widoczniejszych śladów – element ograniczający się najwidoczniej do pospólstwa miejskiego”.
Z badań Jana Fijałka i Marii Łowmiańskiej wynika, że ludność Wilna w połowie w. XVII była w większości katolicka; drugie miejsce pod względem ilościowym zajmowało wyznanie unickie, szybko topniejące na rzecz obrządku rzymskiego; prawosławie liczyło tyleż mniej więcej wyznawców, co protestantyzm; Żydów było tysiąc kilkuset i kilka setek mahometan — Tatarów. Katolicka ludność Wil na była na ogół pod względem językowo-kulturalnym polska oraz w małym procencie niemiecka i litewska; wśród unitów i prawosławnych, dawniej Białorusinów, przeważali od XVII w. Polacy. Polakami byli też protestanci.